补阳还五汤（Buyang Huanwu Decoction，BHD）为治疗缺血性脑中风临床应用最广泛的中药复方，出自王清任的《医林改错·下卷·瘫痿论》，由黄芪、当归、赤芍、川芎、桃仁、红花、地龙7味药组成，大量补气药与少量活血药相配，气旺则血行，活血而又不伤正，共奏补气活血通络之功效，体现“不在逐瘀以活血，重在补气以活血”的配伍特点，是治疗半身不遂、瘫痿不用诸证的首选方。

目前，针对BHD抗缺血性脑卒中的药理作用，主要从改善脑供血及保护神经细胞的结构和功能进行研究，包括抗血栓、改善血液流变学、抗血管损伤及保护血脑屏障、抑制兴奋性氨基酸毒性、抑制炎症因子释放、清除自由基与抗氧化作用、抑制细胞凋亡、促进神经元再生等。近年来，国内外研究者对BHD的药效成分和作用机制分别从“药材、有效部位或组分、有效成分”3个层次和“整体动物、器官组织、细胞亚细胞、分子生物学”4个水平进行深入研究。

尽管关于该方的研究众多，包括化学成分、药理作用、临床疗效等，但研究总体较为分散，且《中国药典》2020年版未收载该方，该方的质量标志物（Q-Marker）尚不明确，也尚无中药复方制剂面世。BHD临床疗效明确，但其化学成分和药理作用靶点众多，且药效物质基础及作用机制尚不明确，故本文以Q-Marker五原则和本团队提出的超分子“气析”理论原则为指导，对BHD化学成分、药理作用进行系统梳理和总结，并针对研究现状提出超分子化学解决对策，为BHD质量控制提供理论参考，促进BHD新药研发和产业化发展。

1 化学成分

1.1 复方化学成分

曹东敏等[1]采用四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱对15批BHD的21个共有峰进行归属和鉴定，其中来源于黄芪的有10个（奎宁酸甲酯、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮苷-6″-O-丙二酸酯、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素等）；来源于红花的有3个（琥珀酰基腺苷、6-羟基山柰酚-3,6-O-二葡萄糖-7-O-葡萄糖醛酸苷、山柰酚-3-O-槐糖苷）；来源于赤芍的有2个（没食子酸、芍药苷）；来源于当归的有1个（香草酸）；来源于地龙的有1个（鸟苷）；来源于桃仁的有2个（苦杏仁苷、野樱苷）；来源于当归和川芎的有2个（阿魏酸、洋川芎内酯H）。

Liu等[2]从BHD样品中鉴定出54个成分，包括4种C-糖基喹诺查耳酮、4种黄酮O-苷、16种异黄酮、6种单萜苷、8种皂苷、4种有机酸和5种氨基酸，其中黄芪中的成分多达29个，而桃仁中的成分只有2个。姚维一等[3]基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS在BHD药液中鉴定出55个化合物，主要为黄酮类如毛蕊异黄酮、槲皮素、芒柄花苷等。由此可知，BHD黄酮类成分最多，其次是苷类成分，建议可进一步加强对挥发油、多糖等成分的研究。

1.2 单味药材化学成分

BHD各单味药材主要化学成分可分为8类，包括挥发油类（除地龙外，其他6味植物药均有，主要为苯酞类）、苷类（主要为黄芪皂苷类和黄酮苷类、桃仁黄酮苷和氰苷、赤芍单帖糖苷类、红花黄酮苷类、地龙核苷类等）及其苷元、生物碱类（主要为川芎嗪、地龙解热碱、黄嘌呤类等）、酚酸类（当归和川芎酚酸类）、多糖类（黄芪多糖、当归多糖、赤芍多糖）、蛋白质类（主要为桃仁蛋白质、地龙蛋白质）、氨基酸类（地龙氨基酸），其他类如萜类、鞣质类、甾体类、酶类等[4-16]。各单味药材主要成分类型及数目见表1。

2 药理作用及主要靶点

BHD主要通过抑制脑血栓形成和神经系统损害抗缺血性脑卒中，其中抗神经系统损害包括抑制兴奋性氨基酸毒性和Ca2+超载、抗炎、抗氧化应激和硝化应激、调节细胞凋亡和自噬、修复血脑屏障和抗脑水肿、提高脑组织能量代谢、促进血管和神经再生等。有研究表明其关键调控机制主要与磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路有关[17]，还涉及到白细胞介素-7（IL-7）信号通路、缺氧诱导因子-1信号通路、高级糖基化终末产物-受体信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等[18-19]。

2.1 抗血栓

血栓的形成与内皮细胞功能和血小板功能异常、血液流变学、血管内膜增生及凝血系统等有关。BHD有效组分生物碱和苷可抑制血管内皮细胞分泌组织型纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活物抑制物-1、组织因子、组织因子途径抑制物、凝血酶调节蛋白mRNA表达及蛋白激酶C（PKC）蛋白表达，从而起到保护血管内皮细胞功能[20]；抑制凝血因子III和血管性血友病因子、P-选择素、溶酶体颗粒糖蛋白63表达[21]。降低模型大鼠血小板活化因子含量，改善血小板的黏附、变形和聚集等活动；血小板活化与酪氨酸激酶、蛋白激酶和p38 MAPK蛋白及其磷酸化表达有关[22-23]。

此外，BHD可降低脑缺血模型大鼠一氧化氮、内皮素、血栓素B2含量，升高降钙素基因相关肽、6-酮-前列腺素F1α、前列腺环素及血管内皮生长因子（VEGF）含量，改善血流动力学和血液流变学，减少血液黏滞性，从而发挥抗血栓的作用。生物碱和苷可增强基质金属蛋白酶9（MMP9）的表达，生物碱还可抑制组织基质金属蛋白酶抑制物-1表达，提示BHD中这2种有效组分可能通过抑制增生内膜中细胞外基质（ECM）的合成，促进ECM的清除和降解以对抗血管内膜增生[24]。黄芪甲苷、苦杏仁苷、芍药苷及其配伍物通过调节细胞外信号调节激酶、PI3K、Janus激酶/信号转导与激活因子信号通路相关蛋白表达发挥抗血管平滑肌细胞增殖作用[25]。

2.2 抗神经损伤

脑血栓后，会引发一系列神经损伤反应，导致细胞膜去极化，产生大量兴奋性氨基酸并导致Ca2+超载，引起氧化应激和硝化应激，并导致炎症反应、脑水肿和能量代谢障碍等一系列连锁反应。

2.2.1 抑制兴奋性氨基酸毒性和Ca2+超载

兴奋性氨基酸，包括谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸，主要为聚集的谷氨酸与N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）结合，引起Ca2+内流，同时兴奋性氨基酸能降低脑源性神经营养因子、神经生长因子（NGF）的释放，抑制钙结合蛋白的表达，引起Ca2+通道开放，共同导致细胞内游离Ca2+超载[26]。BHD通过上调谷氨酸转运体-1及谷氨酰胺合成酶蛋白及垂体腺苷酸环化酶激活肽38表达，促使谷氨酸代谢为谷氨酰胺。且BHD可作用于α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）受体、NMDAR和亲代谢型谷氨酸受体，缓解细胞内Ca2 +超载，从而使热休克蛋白70（HSP70）mRNA表达减少，保护神经纤维[23]；毛蕊异黄酮、刺芒柄花素、川芎哚和芍药新苷等成分作用于谷氨酸受体的活性位点如NR1、NR2A、NR2B等，抑制谷氨酸堆积，发挥神经元保护作用[27]。

2.2.2 抗炎作用

经氧化应激和硝化应激产生大量的过氧化物质，导致中性粒细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞及淋巴细胞等炎症细胞活化，产生各种炎性因子如细胞因子及其受体、趋化因子、黏附因子。抗炎作用包括5个方面。

（1）调控Toll样受体（TLR）：TLR3可直接识别Toll/IL-1受体结构域，激活肿瘤坏死因子受体相关因子3（TRAF3），促进抗炎因子释放[28]。TLR在各种不同机制的免疫炎症反应中发挥重要作用，BHD可有效减少TLR4及调控TLR信号转导通路相关mRNA和蛋白的表达抑制炎症反应[29-30]。

（2）调控炎症因子释放：BHD可下调IL-1、IL-2、IL-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、γ干扰素、一氧化氮等致炎因子激发防御反应，促进组织的修复；同时上调IL-4、IL-10等炎症因子，对抗已经产生的炎症介质；降低IL-8、人巨噬细胞趋化蛋白-1、巨噬细胞炎性蛋白1α等趋化因子的含量和表达；抑制可溶性细胞间黏附分子1、可溶性血管细胞黏附分子l等的表达产生抗炎作用[29]。

（3）抑制细胞焦亡：BHD所含生物碱、苷类、多糖和苷元可能通过抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）表达[28]；苷类成分可降低脑缺血大鼠海马NOD样受体热蛋白结构域3（NLRP3）、ASC抗体、IL-1蛋白、Caspase-1蛋白和Caspase-1前体蛋白的表达，显著抑制炎性细胞焦亡，从而产生抗炎作用[29]。

（4）抑制MMP表达，如MMP3、MMP9等，从而抑制MMP降解和血管内斑块的炎症反应[32]。

（5）调控小胶质细胞以减少小胶质细胞/巨噬细胞的M1型标记物CD16/32表达，抑制CD86、诱生型一氧化氮合酶（iNOS）及其分泌的促炎因子表达，并且增加M2型标记物CD206表达，促进M2型小胶质细胞/巨噬细胞表面标记物CD206、精氨酸酶-1（Arg-1）及抗炎因子和转化生长因子-β（TGF-β）mRNA表达，说明BHD可促进脑缺血后小胶质细胞/巨噬细胞从M1型向M2型转化，抑制炎症反应[33]。

2.2.3 抗氧化应激

BHD类方能有效降低氧化应激模型大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤PC12细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）和胞内活性氧的含量，增加胞内谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量，抑制模型细胞内细胞周期素依赖性蛋白激酶5（CDK5）和tau蛋白的过表达，从而发挥抗氧化应激作用。BHD还可提高超氧化物歧化酶（SOD）与降低丙二醛水平，减轻脑缺血模型大鼠的氧化应激反应导致的脑组织损伤[34]。丙二醛、活性氧、LDH可反映脑组织氧化损伤程度，而SOD、GSH-Px、过氧化氢酶等抗氧化酶能减轻氧自由基引起的脑损伤。此外，沉默信息调节因子1也可作为抗氧化应激的关键调节点[35]。

2.2.4 修复血脑屏障和抗脑水肿

BHD修复血脑屏障和抗作用包括3个方面。（1）稳定血脑屏障超微结构：显著抑制γ干扰素的水平和NF-κB p65蛋白磷酸化，减少脑缺血诱导的趋化因子CXCL10产生，下调MMP2和MMP9水平，上调大鼠血脑屏障紧密连接蛋白（claudin-5、闭锁小带蛋白-1、微管相关蛋白2）的表达，从而改善脑梗死大鼠血脑屏障超微结构破坏；（2）抑制血脑屏障破坏：激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ，降低炎症因子表达，降低细胞间黏附分子-1（ICAM-1）含量，增强IL-10表达，抑制炎性反应，从而抑制MMP9大量表达，降低血脑屏障通透性，减轻血脑屏障破坏；（3）调节脑梗死后血脑屏障通透性：下调MMP9和水通道蛋白4（AQP4）mRNA表达，从而减轻梗死后炎性水肿，保护脑组织[36-37]。

2.2.5 提高脑组织能量代谢

BHD通过提高三磷酸腺苷、ADP含量，并促进大脑分泌去甲肾上腺素、多巴胺和5-羟色胺等，有效改善能量代谢障碍[36]；还可降低乳酸及LDH含量促进能量代谢[38]。

2.2.6 促进血管和神经再生

血管内皮生长因子主要包括VEGF、促血管生成素（Ang）家族因子、碱性成纤维生长因子等，在血管新生过程中具有重要作用。BHD能促进脑出血大鼠脑内Ang-1和内皮细胞TEK受体酪氨酸激酶（Tie-2）mRNA表达，促进血管生成，从而促进损伤组织修复[39]；促进脑出血大鼠脑内损伤区VEGF及其受体mRNA的表达，从而调整血管新生过程[40]。其还能促进NGF、神经元营养因子（NTFs）等20多种多肽类活性物质分泌，诱导神经再生[41]。

2.3 调节细胞凋亡和自噬

脑缺血缺氧、脑血栓及神经细胞损伤后，最终激活凋亡基因表达和凋亡因子释放，导致细胞凋亡。凋亡相关基因通常分为促凋亡和抗凋亡基因[42]。自噬可在脑缺血缺氧条件下被激活，适当的自噬可以保护神经细胞，而过度自噬会导致细胞死亡。BHD可抑制CDK5和下游蛋白tau的异常活化，下调神经元凋亡因子Caspase-3的mRNA表达和B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）相关X蛋白（Bax）/Bcl-2的值[43]；同时上调自噬相关蛋白（人抑癌基因Beclin1和LC3B/LC3A）的表达，提高线粒体动力学蛋白水平，动态调控凋亡与自噬的交互，稳定线粒体功能，保护氧化应激受损的细胞[44]。

还能抑制NGF，调控与凋亡相关的生长因子；抑制p38 MAPK磷酸化，抑制缺血损伤后p38 MAPK/Caspase-3级联通路的活化，减少神经细胞凋亡；进一步拮抗凋亡执行蛋白酶活化[45]。Caspase家族是执行细胞凋亡的主要酶类，其中启动分子Caspase-8、9、10等为蛋白酶级联反应的起始者，效应分子Caspase-3、6、7等则通过裂解细胞的多种蛋白质或酶使细胞凋亡，Caspase-3是细胞凋亡的关键蛋白。此外，还可降低p53、β微管蛋白、死亡因子（Fas）、Fas配体等凋亡相关蛋白水平[46]；抑制泛素结合蛋白p62表达，增加Beclin1含量，降低自噬通路PI3K/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路相关蛋白的磷酸化，从而发挥神经保护作用[47]。

2.4 其他

除了抑制脑血栓形成和神经系统损害，BHD还可通过调控铁死亡、circRNA-miRNA-mRNA三元转录网络及外泌体表达、肠道菌群等途径抗缺血性脑卒中。赵冯岩等[48]利用网络药理学分析得到缺血性脑卒中铁死亡途径关键靶点3个，分别为HSP90α家族A类成员1、表皮生长因子受体、生长因子受体结合蛋白2，及主要京都基因与基因组百科全书通路7条。研究发现70个差异表达的circRNAs和692个差异表达的mRNAs可能与BHD抗脑缺血损伤有关，其可能通过rno_CIRCpedia_8313及rno_CIRCpedia_8013等7个circRNAs，靶向海绵吸附rno-miR-330-5p、rno-miR-370-3p及rno-miR-328等9个miRNAs，间接调控15个mRNA的表达，发挥神经保护作用[49]。

此外，BHD干预组能上调rno-miR-532-5p、rno-miR-338-3p及rno-miR-412-5p表达，下调rno-miR-211-3p及rno-miR-494-3p表达，提示BHD通过调节miRNA谱而保护神经血管单元[50]。陈博威等[51]从外泌体和转录组学的角度探讨了BHD对急性脑梗死患者血清外泌体lncRNA表达谱的影响。结果表明，2组间共有20个差异表达的lncRNA，其中19个下调，1个上调，说明BHD可能通过改变急性脑梗死患者的血清外泌体lncRNA表达谱，发挥抗脑缺血损伤作用。

BHD抗缺血性脑中风调控网络机制图见图1。

3 Q-Marker预测分析

针对中药现阶段质量控制体系不完善问题，刘昌孝院士[52-55]提出了Q-Marker的新概念，从质量传递与溯源、成分特有性、成分有效性、复方配伍环境及成分可测性5方面来论述中药Q-Marker研究和发现的路径，本团队也率先提出基于超分子“印迹性”的中药Q-Marker研究方法[56]，可从这6个方面寻找反映中药安全性、有效性、稳定性、传递性和可测性的指标成分和药效成分，进而对复方质量进行全过程、全方位控制。笔者拟建立BHD的Q-Marker发现的研究路径，见图2。

3.1 质量传递与溯源

Wang等[57]以BHD中药物“黄芪”“当归”“赤芍”“川芎”“红花”“地龙”为关键词，通过数据库共找到780个成分，并以口服生物利用度≥30%，类药性≥0.18进一步筛选得到102个活性成分，其中黄芪21个、红花23个、当归4个、赤芍29个、川芎9个、桃仁23个、地龙5个。最后通过网络药理学分析得到与抗缺血性脑中风密切相关的16个关键成分如β-胡萝卜素、山柰酚、木犀草素，槲皮素、羟基红花黄色素A、黄芪甲苷和10个关键靶点如IL-6、TNF-α等。

中药成分众多，但只有被吸收入血的成分才能产生发挥药效作用。Wen等[58]采用UPLC-Q-TOF/MS从正常大鼠尿液中鉴定得到50个成分，包括5种异黄酮成分、3种皂苷成分、和其他4种类型的成分等12个原型成分和22个代谢产物，代谢产物可分为异黄酮和苯酞类，主要来自黄芪、当归和川芎。沈晓等[59]采用UPLC-Q-TOF-MS/MS对BHD在正常和脑缺血再灌注大鼠脑组织和血浆的吸收成分进行鉴定，发现正常脑组织和血浆中分别有5个和7个化合物，而造模脑组织和血浆中却只有2个和3个化合物，均只有1个共同成分毛蕊异黄酮苷，说明正常和造模血浆和脑组织成分存在差异。

姚维一等[3]基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS在BHD给药后人血浆和人尿液样本分别鉴定出34和23个化合物，主要分为黄酮类（芦丁、毛蕊异黄酮、芒柄花素、毛蕊异黄酮苷和槲皮素等）、苯酸类（阿魏酸、绿原酸、没食子酸等）、苯酞类（洋川芎内酯A、藁本内酯和洋川芎内酯H）和皂苷类（黄芪皂苷III等）。Yang等[60]基于HPLC-DAD-MS在BHD给药后猪血清中鉴定出9个化合物，以黄酮类化合物为主。黄海艳等[61]在大鼠含药血浆中发现了30个入血成分，其中10个为血浆固有成分，1个为溶剂峰，19个为药源性成分，而水提液中被鉴定的6个成分未在血浆中被检测出，提示原型药物被肠道菌群转化为代谢产物。

综上，基于质量传递与溯源，可追踪BHD内780个有效成分到102个活性成分，再结合50个入血成分综合考量，由此确定BHD可能的Q-Marker。

3.2 成分特有性

3.2.1 黄芪成分的特有性分析

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao或膜荚黄芪A. membranaceus (Fisch.) Bge.的干燥根，主要含有苯酞类挥发油、黄酮、皂苷、多糖、氨基酸、微量元素及其他类（酚酸、脂肪烃类、生物碱）。黄酮、皂苷和多糖类是其药效成分，其中黄芪甲苷、黄芪皂苷I、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、槲皮素等成分具有特有性[62-63]，可作为黄芪的Q-Marker。

3.2.2 当归成分的特有性分析

当归为伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels的干燥根，主要含有苯酞类挥发油、单萜和倍半萜类、芳香类化合物、脂肪烃及其衍生物、多糖、有机酸、氨基酸、微量元素及其他类（三萜和甾体、生物碱、核苷、维生素）。苯酞类、酚酸类及多糖类具有多种药理活性，其中阿魏酸、藁本内酯、洋川芎内酯A、I、H、正丁基苯酞等具有很强的特有性[64-66]，可作为当归的Q-Marker。

3.2.3 赤芍成分的特有性分析

赤芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍Paeonia veitchii Lynch的干燥根，主要含有挥发油、单帖糖苷类、三萜类、黄酮、鞣质、酚酸类、糖类、甾体化合物、其他类（醇类、生物碱等）。单萜糖苷类、鞣质、黄酮类和挥发油为主要有效成分，苷类如芍药苷、氧化芍药苷、芍药苷内酯等具很强专属性[20,67]，可作为赤芍的Q-Marker。

3.2.4 川芎成分的特有性分析

川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根茎，主要含有挥发油（苯酞类、烯萜和烯醇类）、酚酸类、生物碱类、多糖类、其他类（萜类、甾体类、黄酮类）。酚酸类、苯酞类、生物碱类是发挥药理作用的物质基础，其特有性成分和当归类似，包括川芎嗪、阿魏酸、阿魏酸松柏酯、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A、I、H等[68-69]，可作为川芎的Q-Marker。

3.2.5 桃仁成分的特有性分析

桃仁为蔷薇科植物桃Prunus persica (L.) Batsch或山桃P. davidiana (Carr.) Franch.的干燥成熟种子，含有挥发油、苷类、黄酮及其苷类、甾醇及其苷类、氨基酸、脂肪酸类、桃仁蛋白、其他类（微量元素、萜类）。其药效成分为挥发油、氰苷、黄酮、桃仁蛋白，主要以苦杏仁苷为其质量评价指标但专属不高，野樱苷的专属性较苦杏仁苷高[70-71]。综上，苦杏仁苷和野樱苷可作为桃仁的Q-Marker。

3.2.6 红花成分的特有性分析

红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花，含有黄酮及其苷、生物碱、聚炔、亚精胺、木脂素、甾醇类、多糖类。黄酮类。其中醌式查耳酮类化合物如羟基红花黄色素A、红花黄色素是红花发挥药理作用的物质基础，也为其他植物中较少见的成分，专属性好且含量高[3]，可作为红花的Q-Marker。

3.2.7 地龙成分的特有性分析

地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum (E. Perrier)、通俗环毛蚓P. vulgaris Chen、威廉环毛蚓P. guillelmi (Michaelsen) 或栉盲环毛蚓P. pectinifera Michaelsen的干燥体，含有蛋白质及多肽类、酶类、氨基酸及二肽类、核苷类、脂肪酸类、甾体化合物、溶血磷脂和无机元素。主要药效成分为蛋白质类、酶类、脂肪酸类、氨基酸，其中纤溶活性蛋白、蚓激酶、蚯蚓纤溶酶、次黄嘌呤、肌苷等专属性很强[25]。因此，蚓激酶、次黄嘌呤及肌苷可作为地龙的Q-Marker。

3.3 成分与药效关联

3.3.1 基于体内成分与药效关联的Q-Marker预测分析

黄酮类成分毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、芦丁和胡萝卜素可降低损伤大鼠脑细胞流动性；羟基红花黄色素A、山柰酚可通过抑制血小板聚集抗血栓[72]；芒柄花素、芒柄花苷可抗缺血性损伤[73-74]。苯酸类的阿魏酸、没食子酸降低血管渗透可保护神经细胞线粒体功能而降低神经细胞损伤；苯甲酸类、洋川芎内酯抗氧化[75]。

苷类如黄芪甲苷、芍药苷、苦杏仁苷可抑制血管平滑肌细胞[76]；6-羟基山柰酚-O-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷抗血小板聚集，改善血液流变学[77]；没食子芍药苷、刺芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷上调血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的分泌，促进血管生成[78]。生物碱类如川芎嗪具有活血祛瘀、抑制血小板聚集、扩张血管、改善血液循环、缓解疼痛等作用[79]。BHD有效成分黄芪甲苷、阿魏酸、绿原酸、毛蕊异黄酮苷、川芎嗪、芦丁、丹皮酚还能显著改善细胞膜流动性从而改善细胞损伤[80]。

3.3.2 基于体外成分与药效关联的Q-Marker预测分析

Zhang等[81]基于大鼠外翻肠囊和人结肠癌Caco-2细胞单层模型，阐明BHD发挥抗脑缺血的化合物为黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、刺芒柄花素、芒柄花苷等。郑华珠[82]采用神经元样PC12细胞膜固相色谱法联合UPLC-MS/MS检测并初步鉴定BHD与PC12细胞特异结合的效应成分，揭示其发挥神经保护的效应成分可能为6-羟基山柰酚-3,6-二-O-葡萄糖苷、6-羟基山柰酚-3,6,7-三-O-葡萄糖苷和毛蕊异黄酮苷。此外，还通过红细胞膜固相色谱法，阐明BHD发挥“行血活血”功效的作用物质基础可能为毛蕊异黄酮、芍药内酯苷、6-羟基山柰酚-3,6-二-O-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷等。

廖丰蕴[83]运用脑微血管内皮细胞膜固相色谱法筛选BHD与脑微血管内皮细胞膜亲和性较高的活性成分，药效验证确定毛蕊异黄酮苷、芍药苷、芒柄花苷、没食子酰芍药苷、7-2′-二羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷均能不同程度对抗脑微血管内皮细胞损伤。王玎[78]运用血小板细胞膜固相色谱法筛选BHD的“行血”药效物质基础，确定了BHD抗血栓和活血化瘀的5个色谱峰，其中2个为芍药苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷。Liao等[84]采用血小板结合实验、固相萃取和HPLC-MS/MS研究BHD介导抗血小板的活性成分，筛选与血小板结合亲和力最强的5个化合物为6-羟基山柰酚-二-O-葡萄糖苷、芍药苷、毛蕊异黄酮苷、没食子酰芍药苷和芒柄花苷。

Yu等[85]采用RBC膜结合试验结合SPE和质谱探讨BHD基于红细胞膜病变的抗脑中风物质基础，发现毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芍药苷和6-hydroxy behenol-3,6-di-O-glucoside是其潜在的药效物质。吴银爱[86]建立神经元样PC12细胞膜固相色谱法筛选BHD发挥“神经保护”药效成分，并得到特异结合的6种成分为6-羟基山柰酚-3,6,7-三-O-葡萄糖苷、6-羟基山柰酚-3,6-二-O-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮苷、没食子酰芍药苷、芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷和7,2′-羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷。

3.4 复方配伍环境

BHD方中各药协同发挥补气、活血、通络的功效。正如《医林改错评注》所说：“方中重用黄芪补气，使气足而血行，经络通畅；配合当归尾、赤芍、川芎、桃仁、红花活血祛瘀，地龙通经络，共同起到补气活血、逐瘀通络的作用”。生黄芪为君药，当归尾为臣药，赤芍、川芎、桃仁、红花为佐药，地龙为使药。大量补气药与少量活血药相配，因此对BHD拆方研究时常把黄芪单独拎出来作为补气组，与活血组和通络组或两两的组合与全方的药效或指标成分含量进行对比研究，研究的层面有基于君臣佐使配伍、黄芪剂量研究等。

大量研究者比较了BHD及其拆方的药效，均发现BHD比拆方的药效更强，说明黄芪与活血药组的配伍使用具有“气旺以促血行”之功[87-90]。雷明[72]通过比较BHD复方颗粒与单味药材中的黄芪甲苷与羟基红花黄色素A的含量，BHD复方颗粒体内代谢后这2个成分的浓度高于单味药材组，说明黄芪和红花配伍能增强BHD的补气活血功效。探讨不同剂量黄芪配伍的BHD对缺血性脑卒中恢复期患者血液流变学及疗效的影响，当大剂量使用黄芪时，更能显著改善患者的血液流变学，有利于缺血性脑卒中患者病情改善和神经功能恢复[73-74]。

3.5 成分可测性

3.5.1 成分含量可测性

根据《中国药典》2020年版记载，BHD这7味药材需进行含量测定的成分有黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、芍药苷、苦杏仁苷、羟基红花黄色素A。王玮玮等[75]采用UPLC-MS/MS法对BHD抗动脉粥样硬化8个效应成分如羟基红花黄色素、芍药内酯苷、芍药苷、苦杏仁苷、黄芪甲苷等进行含量测定，该方法重复性、回收率好。王露等[76]采用超高效液相色谱-串联质谱法同时测定BHD中苦杏仁苷、芍药苷、阿魏酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、槲皮素及芒柄花素这6种成分的含量，该法专属性强、快速灵敏。

饶晓玲等[91]基于HPLC法同时测定BHD中川芎嗪和阿魏酸的含量，本测定方法可靠简便，专属性强，重现性好。王玎[78]建立HPLC法并用于对BHD提取液中苦杏仁苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸进行定量，该法方便、准确，能同时分析这4种成分的含量。Liu等[79]对其中的12个生物活性成分如毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、黄芪甲苷IV、黄芪甲苷I等进行定量分析。Shaw等[80]采用LC-MS/MS技术对BHD的9个成分如黄芪皂苷I、黄芪皂苷II、黄芪甲苷、刺芒柄花素、芒柄花苷等进行定量分析，该方法灵敏、准确、重现性好，便于质量控制。

3.5.2 谱动学和谱效动力学

Zhang等[92]建立多成分谱动学数学模型，并对BHD中黄芪甲苷、芍药苷、苦杏仁苷、川芎嗪、阿魏酸的药动学参数和总量统计矩参数进行计算，发现黄芪甲苷与全方的总量统计矩相似度最高，推测是BHD的Q-Marker。余健烨[93]研究单体成分芒柄花苷和芍药苷在MCAO模型大鼠体内的药动学过程，说明BHD抗脑缺血损伤作用可能与其体内抗氧化作用有关。陈思阳[94]建立PK-PD数学模型，探讨8个入血成分（藁本内酯、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、阿魏酸、羟基红花黄色素A、3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷、胡萝卜苷、苦杏仁苷）与9个效应靶点之间的量-时-效关系，说明这8个成分主要对ICAM-1、MMP9、TNF-α等靶点起效应。

3.6 基于超分子“印迹性”和网络动力学的抗缺血性脑卒中物质基础研究

杨岩涛[95]建立4成分（川芎嗪、芍药苷、苦杏仁苷及阿魏酸）与4靶点（Caspase-3、VEGF、TNF-α、IL-6）的网络谱效动力学数学模型，以平衡常数表征成分与靶点间“印迹模板”的“印迹性”作用大小，说明这4成分4靶点在BHD抗脑缺血网络体系中具有相对较高的地位。樊启猛[96]针对BHD抗脑缺血的20个成分和20个靶点进行网络动力学研究，测定成分群与靶点群间的网络作用平衡常数，获得平衡常数矩阵，再求算特征值和特征向量，依据特征值与特征向量的对应关系，按贡献率排序，得到累计贡献率达95%的9个成分和13个靶点，这9个关键成分即刺芒柄花苷、羟基红花黄色素A、3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷、胡萝卜苷、洋川芎内酯H、藁本内酯、苦杏仁苷、异黄芪皂苷I、毛蕊异黄酮。

综上，BHD中的黄芪甲苷、黄芪皂苷I、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、槲皮素、阿魏酸、川芎嗪、藁本内酯、芍药苷、苦杏仁苷、羟基红花黄色素A这13个成分具有药理活性，专属性高、可测性强、便于质量控制可作为BHD的Q-Marker。

4 结语与展望

近年来，Q-Marker的预测分析已用于多种中药及其复方，包括肉豆蔻、细辛、天舒胶囊、当归四逆散等中药和复方[97-100]。本文基于其传递与溯源的属性，以复方有效性为核心，成分可测性和成分特有性为条件，并结合复方的配伍环境和超分子“印迹性”对其Q-Marker进行预测分析，寻找与BHD药效关联强、专属性高、可测性好的Q-Marker（包括黄酮类、皂苷类和生物碱类），为BHD进一步研究和开发、质量评价体系建立和完善提供参考依据。

目前关于BHD化学成分和药理作用的文献较繁杂，缺乏不同研究指标之间的关联，应对已有文献信息进行整合、凝练、总结、升华。化学成分主要针对黄酮、皂苷、生物碱类成分，而对其他有效成分如多糖、挥发油等研究较少；研究表明黄芪多糖和当归多糖等具有显著的增强免疫作用，故这些化合物的深入研究可丰富BHD的临床应用及新药开发依据。此外，单一成分或靶点与机体的纵向关联研究较多，不同成分与靶点之间的横向联系及其与脑缺血的病理特征联动机制研究较少；多以单成分单靶点的思路进行研究，缺乏成分与成分间、成分与靶点间的作用机理研究；且定性研究多，定量研究少，成分与靶点的贡献率大小一直未能突破，这个问题也是实现中医药现代化的卡脖子关键技术。中药复方以多成分作用于多靶点，整体协同发挥药效，因此成分与靶点间的作用机理不可忽视。

围绕着成分与靶点（Q-Marker）作用机制研究，本课题组也在致力于从生物超分子化学和定量药理学角度将中药成分与靶点群进行关联成“印迹模板”并进一步根据“印迹模板”性质进行整合，最终从定性和定量2个层面验证药效成分和靶点的作用关系：首先采用匹配频数统计矩法分离出“印迹模板”，再采用分子连接性指数和总量统计矩参数表征“印迹模板”特征，并进一步对“印迹模板”特征、“印迹模板”印迹性（色谱参数）和药效靶点进行关联，从整体上找寻与药效及“印迹模板”印迹性关联性最强的成分与靶点群，锁定药效“印迹模板”；进一步通过中药定量谱学如谱动学、谱效学、谱效动力学、网络动力学等数学模型对药效“印迹模板”（成分与靶点群）贡献率大小进行排序[56,101-102]。

这种印迹性的中药及复方质量评价方法的建立将能够极大地缩小实验验证的难度，从整体上对筛选得到的成分与靶点群贡献率进行排序，寻找和验证BHD质量控制指标，为其研制成中药新药奠定基础。此外，多组学技术如基因组学、蛋白组学、转录组学、翻译组学、代谢组学、微生物组学、本草物质组学也能从整体上阐明中药复方微观作用本质。

故本文对BHD化学成分和药理作用进行系统综述，寻找关键的成分与靶点群，下一步将运用本团队建立的超分子印迹性质量评价方法，进一步锁定和验证关键的Q-Marker，全面揭示中药多成分在体内产生药效的物质基础及作用机制，最终揭示中药复方整体效应的科学本质及其内涵，推动BHD质量标准建立。

来 源：李海英，贺 鹏，李文姣，杨 磊，唐 林，胡 超，邓凯文，潘 雪，贺福元．补阳还五汤化学成分、药理作用研究进展及质量标志物（Q-Marker）预测 [J]. 中草药, 2024, 55(13): 4575-4587.