刘舒宇等 南京林业大学学报

杨柳科（Salicaceae）是一个具有重要生态和经济意义的开花植物类群，Hallier首次提出杨柳科与大风子科（Flacourtiaceae）有较近的亲缘关系。随后，一些研究基于两个科的花粉学、木质部解剖结构、次生化合物、DNA序列，也相应证明了这两个科之间具有较近的亲缘关系。

从传统分类角度，杨柳科仅包括杨属（Populus）和柳属（Salix），也称狭义杨柳科（Salicaceae sensu stricto）。基于分子数据，Chase等将大风子科的大部分物种划入到杨柳科中，少部分物种划分到青钟麻科（Achariaceae）中。被子植物分类系统（APG II）正式将大风子科的大部分属划入到杨柳科中。随着被子植物分类系统的不断完善，现在的杨柳科包括了56个属，约981个种。

此前，利用分子数据构建了杨柳科的系统发育关系的研究主要集中与杨属和柳属。由于缺乏通用的核基因引物，杨柳科新增属的属间系统发育关系一直没有得到很好解决。与细胞器基因相比，单/低拷贝核基因是直系同源序列，含有双亲的遗传信息以及提供更多的信息位点，满足在不同分类阶元的系统发育研究。

因此，本期推荐论文研究基于狭义杨柳科的单拷贝核基因位点，设计开发适用于杨柳科的单拷贝核基因引物。这些单拷贝核基因引物的开发与应用将推动后续杨柳科物种系统发育的研究。

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题 目

杨柳科单拷贝核基因引物的开发与利用

基金项目

国家自然科学基金面上项目

作 者

刘舒宇1，刘　霞2,1∗，李金花1∗ ，王兆山1∗

作者单位

1. 中国林业科学研究院林业研究所；2. 重庆文理学院特色植物研究院

关键词

单拷贝核基因；杨柳科；多态性；系统发育关系

▶引文格式：[1]刘舒宇,刘霞,李金花,等.杨柳科单拷贝核基因引物的开发与利用[J].南京林业大学学报(自然科学版),2019,43(5):44-50.DOI:10. 3969/ j. issn. 1000-2006. 201811015LIU S Y,LIU X ,LI J H,et al.Development of single copy nuclear gene primers for the family Salicaceae[J].Journal of Nanjing Forestry University(Natural Sciences Edition),2019,43(5):44-50.

01

目 的

由于现有的遗传标记比较单一且变异太少，杨柳科(Salicaceae)属间系统发育关系还存在较大的争议，需要开发在种间变异大且信息量多的标记来准确揭示杨柳科属间系统位置。相比胞质基因组，单拷贝核基因具有双亲遗传、携带大量信息位点和直系同源的特点，可以满足不同系统发育问题及不同分类阶元研究的需要。

02

方 法

根据先前研究中发表的 15 个杨柳科(杨属、柳属)单拷贝核基因标记以及核糖体 DNA 的转录间隔区序列(ITS)，选取杨柳科 4 个属的代表物种:箣柊(Scolopia chinensis)、大果刺篱木(Flacourtia ramontchi)、爪哇脚骨脆(Casearia velutina)、天料木(Homalium cochinchinense)进行 PCR 扩增测序，以测序结果为参考序列,设计合适的引物。利用杨柳科 6 个不同属的代表物种:山桂花(Bennettiodendron leprosipes)、柞木(Xylosma congesta)、锡兰莓(Dovyalis hebecarpa)、栀子皮(Itoa orientalis)、山桐子(Idesia polycarpa)、山拐枣(Poliothyrsis sinensis)来验证引物的通用性。利用箣柊一个自然居群中的 20 个个体对新引物进行多态性计算以及中性检验。将单拷贝核基因序列和 ITS 序列组合成联合片段,分别用最大简约法和贝叶斯法构建系统发育树。

▲高速裂解样品研磨仪

▲台式冷冻高速离心机对样品进行离心

▲制作琼脂糖凝胶

▲箣柊20个个体的DNA风干过程

▲PCR仪

·试验材料

首先选取了杨柳科不同属的10个物种，另外箣柊属（Scolopia）的箣柊（Scolopia chinensis）同时又选取了20个个体。青钟麻科的海南大风子（Hydnocarpus hainanensis）作为构建系统发育树的外类群。杨属柳属的数据来源于美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）

·引物设计过程

首先，随机挑选了试验材料中的4个物种：箣柊、大果刺篱木（Flacourtia ramontchi）、爪哇脚骨脆（Casearia velutina）、天料木（Homalium cochinchinense），利用15个狭义杨柳科单拷贝核基因位点进行PCR扩增。筛选能够扩增出单一条带的目的片段，送至公司进行测序。第二步，我们以测序结果为模板，使用软件Primer Premier v5.0设计新的核基因引物。第三步，使用新设计的单拷贝核基因引物，分别对剩余6个物种（山桂花Bennettiodendron leprosipes、柞木Xylosma congesta、锡兰莓Dovyalis hebecarp、栀子皮Itoa orientalis、山桐子Idesia polycarpa、山拐枣Poliothyrsis sinensis）进行PCR扩增，验证单拷贝核基因引物的通用性。使用新设计的单拷贝核基因引物，对箣柊的 20 个个体进行 PCR 扩增，根据测序结果序列进行核酸多样性分析，验证核基因引物的多态性。此外，我们还利用 ITS 序列对 10 个物种进行了 PCR 扩增。

·数据分析

将测序结果使用软件 Clustal X 和 BioEdit 进行编辑和比对，杂合子位点使用相应的字母（rA+rG = R, rA+rC = M,rA+rT = W, rC+rT = Y, rC+rG = S, rG+rT = K）。利用DnaSP v5.10对箣柊20个个体的序列进行PHASE运算。分别统计每个位点的单倍型数目（H）、分离位点数目（S）、两两之间碱基突变个数（π）、平均核苷酸差异数（κ）、每个位点的最小重组事件（Rm）、核苷酸多样性（θw）、。中性检验计算每个位点的 Tajima’s D 值，Fu 和 Li’s D*值和Fu 和 Li’s F*值，检验位点是否偏离标准中性模型。

利用最大简约法（MP）和贝叶斯推理法（BI）分别对单拷贝核基因+ITS联合数据建树，使用软件 PAUP v4.0 b10 构建MP系统发育树。所有性状状态进行同等权重、无序处理。采用启发式搜索，树二等分再连接的枝长交换法，自展值 1000 次重复，验证系统发育树可靠性。

利用软件 jModelTest v2.1.1 计算出BI法建树时所需要的最佳核苷酸替代模型，以AIC（Aikaike Information Criterion）为标准，选择最佳核苷酸替代模型。利用软件 MrBayes v3.2.1（构建BI系统发育树。输入最佳核苷酸替代模型参数，采用MCMC算法，两次同时运行 4 条链。贝叶斯分析运行1 000 000代，每隔100代取样一次。舍弃前25%的树作为burn-in，用剩余的数据产生50%一致树，并估算各分支后验概率值。利用 FigTree v1.3.1 对所有系统发育树进行编辑处理。

03

结 果

在 10 个属中成功筛选设计出 6 对合适的引物，分别为 5 对单拷贝核基因标记以及 ITS 遗传标记，各引物扩增出的序列长度为 297~716 bp。多态性检测结果表明：单倍型数目(H)为 3~9 个，平均核苷酸差异数(κ)为 0. 644~2. 278，核苷酸多样性(π)和 Watterson 核苷酸多样性参数(θw )分别为 0. 00104~0. 00451 和 0. 00119~0. 00475，所有位点在箣柊中核苷酸多样性较高。中性检验结果表明所有位点均符合中性进化假设。利用位点联合方法构建的最大简约树和贝叶斯树的拓扑结构基本一致，各分支均有较高的支持率。

▲11个物种DNA的琼脂糖凝胶电泳图

▲新核基因引物的琼脂糖凝胶电泳图

研究基于狭义杨柳科的 15 对单拷贝核基因位点，开发了 5 对适用于杨柳科单拷贝核基因引物，扩增能力好，扩增序列长度为 297 bp~716 bp，通用性较高，ITS 序列在 10 个物种中的扩增能力也非常好。单倍型数目为 3 个到 9 个，引物 DF6 分离位点数最少（2个），DF8 的分离位点数最大（9 个）。平均核苷酸差异数（κ）为 0.644~2.278，重组事件（Rm）个数为 0 个到 1 个。π 值为 0.00104–0.00451。θw 值为0.00119–0.00475，表明所选位点在箣柊中核苷酸多样性较高。Tajima’s D、D*、F*中性检验结果表明所有位点均符合中性进化假设（P> 0.05）。

在系统发育树上，所有杨柳科物种聚在一起，爪哇脚骨脆先分离出来，剩余可主要分为三个分支：（1）箣柊与柞木聚为一个分支；（2）杨属，柳属，山桂花，山桐子，栀子皮，山拐枣聚为一个分支，山桐子与杨属柳属亲缘关系最近；（3）锡兰莓与天料木聚为一个分支。

04

结论

筛选出的 6 对通用性高的引物，丰富了杨柳科的分子标记，可为杨柳科属间系统发育学以及杨柳科植物的遗传多样性的研究提供参考。

基于15个狭义杨柳科植物的单拷贝核基因位点，我们开发设计了新的核基因引物，该方法简便易行。尽管这些核基因序列的长度相对较短，但它们含有丰富的遗传信息。本研究构建的系统发育树，与先前研究的系统发育结果以及物种形态学数据是大致相同的。利用了箣柊的1个自然居群20个个体，评价了5对核基因引物的遗传多样性指数，并进行了中性检验。结果表明所选位点在箣柊中遗传多样性较高并且符合中性进化假设，是研究杨柳系统发育的有益资源。但是，在未来的研究中还需要更多的杨柳科物种，来进一步验证这些核基因引物在其他杨柳科物种中的通用性。