Taq还是Pfu？我全都要！
“我全都要”的梗早在T3 Super PCR Mix时已经用过一次了，不过仍然在网上流行，Master Pol我就再用一次，作为标题还要吸引人，如果再没人看，马炮要砸锅卖铁去韩国一趟，然后回来爆照片，赚取眼球了——唉，想做网红也是一条艰难的路……
上周的公众号上线公告，没想到的“马炮”走红，真是出乎MP本人的意料啊。其实，MP还是想严肃认真的写一些有用的东西的，不过既然诨名流行，一板一眼的枯燥科普没人想看，马炮老师就不妨偶尔闭着眼睛乱“开炮”了，大方之家若是见了，尽可一笑哂之。
起底“PCR”的前世今生
PCR,是PolymeraseChain Reaction的简称，聚合酶链式反应。这个技术严格的发明人应该是Kary Mullis。1983年某日，天气晴朗，这老哥开着小车沿着加州海岸公路急速奔驰，灵感突然降临，于是通过不断升温降温来控制DNA聚合酶体外（In Vitro）合成DNA链的方法就Get了。当然，那时候所用的酶是来自大肠杆菌的DNA Polymerase I ,还不是耐热的，变性DNA的温度足以使其失活。所以操作中每一次循环都要补充酶。
那时，Thermus aquaticus这个耐热的菌株已经由T.D.Brock在美国黄石国家公园发现了（Yellowstone）,只是提取用于PCR的Taq Polymerase要等到1988年才被应用。（PS:马炮老师也是这年出生，嗯，冥冥中自有天意么)。
Taq DNA聚合酶应用于PCR是分子生物学上一个非常重要的事件。马炮认为，使用耐热与不耐热的聚合酶，差别是明显，优势是居大的。在之前，聚合酶太脆弱了，容易失活就不容易提取与保存，使用也繁琐，而自从有了耐热的聚合酶，无论你是麻省理工的教授，还是中国XX学院的本科生，都可以PCR搞起来。这有点像智能手机的普及，可用性大大增强了，那么应用当然也广泛了。
图1 黄石公园的热泉和泉水中分离得到的Thermus aquaticus菌株
PCR最开始于分子生物学这一学科领域，然后拓展到生命科学的各个学科。无论养小白鼠的，还是下田育种的，都会用到PCR。然后是医疗诊断-如病原菌检测，法医-身份身份鉴定等等，真是不一而足。
现在搞生命科学而不懂PCR的，那就不Fashion。君不知现在连物种鉴定都很依赖分子生物学手段。在人们可以随心所欲的体外合成蛋白质的那天到来之前，当前分子生物学的核心基础，当仁不让地是DNA的复制与操控了。
自Taq应用以后，人们受到启发，开始寻找极端环境生物，尤其是耐热微生物来源的其他有用的酶类。另一方面，Jin酒虽好，不能贪杯，Taq虽好，亦非万能:学者们渐渐发现Taq用于扩增长片段能力是不足的，而且保真度对某些实验来说也不够好。于是就有了以Pfu为代表的另一类DNA聚合酶被开发出来。Pfu最主要的特色就是保真度有了6倍左右的提高，而且扩增长片段效果稍好于Taq。
那么，Taq与Pfu，究竟哪个好呢？这个马炮也没有答案。曾经有一个类似的问题摆在马炮面前，想买一辆车，不知道选奔驰好，还是宝马好。奔驰大气，舒适，有面子，而宝马操控好，动力足，外形年轻时尚，而且还跟马炮老师有一个共同点：都有马。马炮老师绞尽脑汁，比考试选A选B还纠结地度过了48小时后，最后终于做出了让家人满意的抉择——宝来，这个买得起，就不能全都要吗？啊……啊？！！！
当然，作为分子生物学研究者的读者们，你们当然可以将Taq与Pfu通通买了，也不贵，也就千儿八百的一管吧，0.2mL，两滴香油的量，涂开了都覆盖不了半张小脸……
Taq的360度详细解析
在解析Taq之前，容马炮先来说道说道在体内的DNA聚合酶的一些基本信息。话说，按生物分类的三域学说，我们可以将所有有细胞结构的生命体（病毒，朊病毒除外）分为三个域，细菌（Bacteria），古菌(Archaea)，真核生物(Eukarya)
Carl Woese的“三域学说”
俗话说“道不同不相为谋”，这三兄弟很早很早以前就分家了，之后各自按照自己的进化路径演化着，才有了当今的千万种动物植物微生物的花花世界。生命体内DNA虽然不能恒久远，但是DNA聚合酶却不断的复制着DNA,所以DNA也可算是“永流传”的不灭之物了。
三类生命体的细胞结构不同，控制代谢的各种酶也有差异。分化一直在进行，从未停止过，同源蛋白质可能一级结构（氨基酸序列）不大相同，但是其二级结构之间的差别要远小于一级结构，并且功能基本是一致的。
在所有的生命体的DNA聚合酶可大体上分为A,B，C，D,X，Y,RT七类。具体分类名称，物种分布及代表见下表：
并不是每类生物体内都有以上七类DNA聚合酶，细菌界较为简单，真核生物最复杂，古菌介于二者之间。简单地说一下各种聚合酶的功能，同样是聚合酶，有的负责复制DNA,有的负责修复DNA。而同样是复制DNA,有的以DNA作为模板（此篇重点讲的Taq与Pfu），而有的以RNA为模板（反转录酶，RT）,有的不需要模板，随机催化dNTP的掺入。
此为理解聚合酶区别的大前提。下面进入详细描述：
TaqDNA Polymerase
来源：Thermusaquaticus,为真细菌的DNA Pol I类，A FamilyDNA Polymerase。
性质：5—3外切酶活性，5-3聚合酶活性，无3-5`外切酶活性。
氨基酸数目：832
扩增特性：产物3端加A。
保真度：⭐⭐⭐（大约百万分之一，也就是copy 1Mbp会有1个出错）
价格：⭐⭐⭐⭐（生产商太多了，价格就低了）
易用性：⭐⭐⭐⭐⭐（你懂的，简直出街（gai）入室（Lab)之必备良品）
Taq蛋白结构示意图（PDB：1TAQ)
作为明星聚合酶成员，人们对Taq的研究可谓十分详尽。如果时间允许，并且有人会给我博士学位的话，马炮可以为此写上十万字的关于Taq的研究论文，这样马炮将从MP摇身一变为PhD炮，射程更远，威慑能力更强，从中国东北发一炮，绕过阿拉斯加，半小时就到华盛顿DC了。
Taq所在的A家族还有一些小弟，如Tth,Tfi,Tbr,Tfl, Tma,Tne等，除了Tth在有锰离子存在下有反转录活性，而有所开发外，其它甚少被研究，点到即止。没办法，Taq战斗能力太强了。
野生的Taq为克隆自Thermus aquaticus，没有氨基酸突变的酶，可以简称为Taq WT。这是一个全长的Taq(至少832个氨基酸组成，因为涉及纯化标签或重组),市场上比较有名的rTaq即为此类代表，当然TAKARA有没有改造，不得而知，全长重组的Taq当属这一个。
如果截断了N端的部分氨基酸，Taq仍然具有活性。因受伤而肢体缺少的张三还是张三，但是缺少部分氨基酸的Taq就不叫Taq了。
少了3个氨基酸，Amplitaq；
少了234个氨基酸，Klentaq;
少了289个氨基酸，Stoffel Fragment，简称Taq SF。
马炮曾进一步缺失少304个氨基酸，简直快到能缺失的极限了，MPTaq，也是个狠人。
缺失N端这么多的氨基酸，顶多会影响5-3外切酶活性，而不会对聚合酶活性造成大的影响，甚至，因为少了这么一个N端结构域，Taq更加耐热了。
Taq的5-3外切酶活性对普通PCR扩增不重要，但是对于探针法(TaqMan)qPCR，这一外切酶为探针水解所必需，则是万万不可或缺的。
如果对Taq的保真度不满意，还可以使用Taq+Pfu，即一个A类聚合酶为主体，另外加入部分具有校正功能的高保真聚合酶，就可以提高保真度，获得大致相当于单独使用Pfu的保真度，并且还能扩增长片段，Taq Plus就是指这类混合酶（Polymerase Blends），早在iPhone 6之前，此Plus就已经“加”上了。而长片段扩增Long Amplification,即LA PCR，也是基于这种混合酶的技术的。TAKARA家的名号响当当的LA Taq系列产品属于这种技术的典型。
在第一代自动化测序（Sanger法）中，所使用的DNA聚合酶也是基于Taq改造的，以平衡Taq对四种核苷酸掺入的偏爱性（bias)。这个将来马炮会单独在测序相关的期号内介绍。
我们知道，普通PCR所使用的模板是提纯了的DNA,这在最初的时期是相当规范的要求。但是随着技术的发展，人们不满足于每次都要制备纯净的DNA了。或者其他必须加入某种试剂，如染料溴酚蓝等，或者SYBR法的qPCR，SYBR对酶活性的抑制促使研究者去探索更耐受SYBR的聚合酶突变体。于是适应不同情景下的PCR的相关Taq也在发展着。
如李四每天要处理大量血液样本的PCR鉴定，有一天李四忙不过来，设想如果不提取血液的DNA，直接扩增岂不是能省下大量时间于金钱；
比如赵五需要提取土壤总DNA后PCR,但是土壤内的微生物次级代谢产物等残留影响聚合酶活性，他想要耐受能力更强的聚合酶；
比如王七（他也许大概排行老七，真的没有弟弟）不想闻到提取植物DNA所用到的巯基乙醇的味道，有毒的CTAB也让他投鼠忌器,那他就想到要用更简单的方法处理模板，而酶活性要足以扩增……
所有的需求都呼唤着更强扩增能力，更强耐脏能力，更快速扩增的DNA聚合酶。
Where there is a will ,there is a way。有志者，事竟成。于是多少个像马炮这样的生物民工不舍昼夜，辛苦研究，反复探索，只为奉献最好的DNA聚合酶，以满足实验员日益懒惰内心需求……
然后赚取你们的科研经费或者研发经费。
于是各种突变体的酶出现了，免提取模板的直扩PCR产品也应时而出。
下面简要讲一下如何改造一个聚合酶以满足某方面的需求。
第一类，提高耐受某种抑制物的能力。定点突变是不错的方法，根据DNA-氨基酸序列的对应关系，通过突变表达载体上的酶编码序列（CDS）来改造酶。
第二类，解除抑制或者其他妨害扩增产量的因素：可以增加某种辅助因子。
第三类，增大扩增速度：通过蛋白质工程技术，这个改动就较大了，堪比人们耳熟能详的器官移植。不过分子级别的蛋白质工程技术，操作的多半还是DNA,重组，删减编码序列等等。
但是关于怎么改造酶的活性，恐怕还没有清晰的理论成型。上半年Alpha Go打败柯洁的新闻过去不久，李开复老师又又又出了Another one 畅销书，AI未来，马炮拜读后诚惶诚恐，生怕哪天人工智能取代了自己，只能“落魄离京白日斜，吟鞭东指即天涯”，回老家种地都比不过机器人能干了……
还好，生命科学和围棋不同，物种太多，特例太多，认识的道路也是曲折迂回。在被AI取代之前，马炮还能搞几年。
由于篇幅限制，关于Pfu的内容将在下期与大家见面。
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参考文献
- Nucleic Acid Polymerases. K.S.Murakami,M.A.Trakselis,Springer,2013
- Brock biology of Microorganisms,Fifth Editon.Pearson,2018
- Master Pol`s personal experience.Tsingke Biotech,2018
