文|易霄寒

编辑|易霄寒

前言

水稻Hd3a是受光周期调控的开花时间决定基因，其蛋白结构上存在一个独特磷脂酰乙醇胺结合蛋白结构域，是PEBP基因家族的重要成员，该家族基因编码的蛋白，在不同的物种中高度保守，并参与调控多种生物发育过程。

在大多数情况下，PEBP家族单个基因的确切分子功能仍是未知的，总的来说，PEBP基因似乎是各种信号通路的调节器，控制生物的生长和分化。

而植物激素脱落酸（ABA），在植物的各种发育过程和对环境刺激的适应性应激反应中，发挥着关键作用。

我们的工作首先是对Hd3a基因序列进行分析，发现该基因启动子区域含有ABA响应元件ABRE。

RT-qPCR和荧光素酶标记实验表明，ABA可抑制Hd3a的启动子抑制该基因的表达。

通过对在ABA处理条件下，野生型日本晴和hd3a缺失突变体种子，萌发期表型进行统计观察，发现hd3a缺失突变体种子萌发对外源ABA更加敏感，且突变体中下游靶基因ABL1､ABI5的表达相较于野生型有一定程度的提高。

我们的研究表明，Hd3a参与调控水稻种子的萌发与ABA相关通路有关，丰富了该基因在作物中的功能信息。

材料与方法

研究中所用的转化菌株为大肠杆菌EscherichiacoliTop10、农杆菌转化菌株AgrobacteriumtumefaciensGV3101、植物瞬时表达载体pCAMBIA1306、pCAMBIA1381Z-LUC，这些都为本实验室保存。

研究中所用的水稻材料，均来自于粳稻品种日本晴亚种；Hd3a缺失突变体材料，来源于本实验室前期，在野生型日本晴水稻背景下，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的Hd3a突变体。

水培法：取新鲜种子置于含清水的培养皿中，浸泡催芽，期间定期换水，黑暗条件下培养10~15天，随后用得到的黄化苗进行后续各类实验。

固体培养基法：配制MS培养基（称量2.4gMS0222，30g蔗糖，3.5gPhytogel），加至600mL纯水中搅拌混匀后，调pH值到5.6~5.8，补至1L后加热至固体物质溶解，分装至生根管封口后，高压118℃灭菌30min，室温凝固后备用。

若要进行ABA处理，可在凝固前加入不同浓度的ABA，注意分装时最好体积一致，便于计算ABA的浓度）。

接着我们取大小均一的种子，去除颖壳，用0.1%砷汞消毒20~30min，无菌水冲洗3次，随后均匀平铺于MS培养基上，短日照（光照10h，30℃；黑暗14h，28℃）条件下培养，2~3d种子开始发芽时，即可进行萌发实验表型的统计观察。

后续分子实验所用的材料，首先在MS培养基上培养7~10d，然后将该水稻幼苗，转移到水稻营养液中，继续生长7d后，移栽到上海江湾试验田，培养至抽穗期取材处理。

本实验所用的烟草材料为野生型本塞姆氏，种植方法：将烟草种子播入土中，保鲜膜覆盖保湿，置于温室（28℃，相对湿度80%，16h光照/8h黑暗条件下）培养，发芽后再进行移植培养备用。

再使用50μmol/LABA，对野生型水稻叶片进行处理，处理时间分别为0h，0.5h，1h，1.5h，2h，取材置于液氮中保存，充分研磨后，用TRIzol法抽提RNA，依据试剂盒说明书将目的RNA反转录为cDNA，并通过荧光定量PCR（RT-qPCR）对Hd3a的mRNA水平进行检测，ACTIN2用于作为基因表达内参。

利用同样的实验方法，分别在野生型和Hd3a突变体中取材，进行RNA的获取，以检测下游作用元件NCED､ABL1､ABI5的表达情况。

Hd3a表达及调控元件生物信息学分析

利用PlantCARE数据库，分析了Hd3a的启动子序列（起始密码子ATG上游2189bp），预测出几个与逆境反应相关的顺式作用元件，包括MYB元件，其核心序列为TAACTG，此序列对干旱和ABA应答。

在拟南芥、水稻、大豆等物种中，ABRE是非常保守的，为反式作用因子提供结合位点，在ABA信号传导过程中发挥着非常重要的作用，由此推测，Hd3a可能会在ABA信号响应相关的发育过程中发挥作用。

同时，我们利用RiceeFPBrowser，分析了Hd3a在水稻体内的表达谱，发现Hd3a在种子､花穗等部位表达量相对较高，在幼苗的叶片，根中的表达量相对其他组织较低。

RNA-seq数据柱状化后也与组织图相符，这些结果表明，Hd3a的转录表达具有组织特异性特点，并且很可能受到ABA信号调控。

外源ABA处理能够抑制Hd3a的转录表达

基于前期对Hd3a启动子序列及其基因在组织中表达情况的分析，我们猜测，Hd3a可能会受到ABA的诱导，因此，我们使用外源ABA对野生型水稻叶片，进行了不同时间段的瞬时处理，并通过RT-qPCR，对各材料中Hd3a表达量进行检测鉴定。

结果显示，在50μmol/LABA处理后，Hd3a基因的表达量显著降低，同时随着处理时间的延长，Hd3a的表达逐渐较少，表明外源ABA处理可以抑制Hd3a的表达。

继而，我们采用荧光素酶报告系统，深入分析ABA对Hd3a表达的影响。

首先将Hd3a的启动子克隆到含有荧光素报告基因的pCAMBIA1381Z-LUC载体上，获得PHd3a-LUC植物表达载体。

再利用农杆菌转化侵染，将质粒导入烟草叶表皮细胞，在室温暗培养2d后，剪取烟草叶片，然后用50μmol/LABA对植物材料进行处理，使用发光仪对检测荧光信号进行检测。

同时，设置不受ABA诱导的PFT-LUC载体，作为对照，PFT-LUC和PHd3a-LUC的荧光信号在当用ABA处理10min后，我们可以看到，PHd3a-LUC荧光信号相较于正常条件下有显著的减弱，对照PFT-LUC荧光信号无明显变化。

同时，我们使用ImageJ软件，对荧光信号进行定量检测发现，经ABA处理后，PHd3a-LUC的荧光信号明显减弱，表明ABA对Hd3a基因表达的抑制作用是通过抑制Hd3a的启动子实现的。

hd3a突变体种子萌发对外源ABA更敏感

为研究Hd3a在种子萌发中的生物学功能，我们利用实验室前期构建的Hd3a突变体，进行种子萌发相关的实验。

将新鲜去壳的饱满种子，铺在添加不同浓度（0､5､10μmol/L）ABA的培养基上培养，并统计观察正常条件下，和ABA处理后野生型、hd3a突变体种子的萌发表型。

正常生长条件下，hd3a敲除突变体没有明显的缺陷，其种子的萌发表型与野生型无显著差异，然而，当用5μmol/L外源ABA处理后，与野生型相比，突变体种子的萌发被抑制。

当进一步提高ABA的浓度，在10μmol/LABA处理条件下，野生型种子的萌发，相较于正常条件下受到抑制，但仍有萌发，而hd3a突变体种子萌发被完全抑制。

同时，通过使用ImageJ软件对胚芽进行统计，我们发现，ABA处理后hd3a突变体萌发受限，生长尚在胚芽时期，明显晚于野生型。

这些结果表明，Hd3a功能缺失，使得ABA在种子萌发过程中的抑制作用加剧，也就是说，Hd3a在ABA相关的种子萌发过程中，很可能起到负调控因子的作用。

Hd3a负调节ABA合成和信号通路相关基因表达

为了在分子水平探究Hd3a对ABA响应的调控，我们使用RT-qPCR技术，检测了水稻野生型和Hd3a突变体中的ABA合成和信号相关基因的表达，其中NCED是ABA合成途径的关键酶，可催化9-顺-环氧类胡萝卜素的裂解反应，该反应形成的产物是合成ABA的前体物质。

而ABL1、ABI5作为bZIP转录因子的成员，已被证明是植物种子萌发过程中ABA信号通路的核心转录因子。

RT-qPCR结果显示，Hd3a功能失活对NCED的转录水平影响不明显，而在hd3a突变体内ABA信号转录因子ABI5､ABL1的表达量均明显高于野生型。

这些结果说明，Hd3a的缺失能够增强ABA信号通路相关正调控因子的表达，这与hd3a突变体展现出更敏感的ABA依赖的种子萌发抑制的表型相一致，暗示了Hd3a抑制ABA信号通路相关基因表达，从而负调节ABA依赖的种子萌发抑制过程。

讨论

PEBP基因家族在植物中成员众多，结构非常保守，在植物的种子萌发、开花调控和组织发育等多个生命过程中，发挥着重要作用。

目前，在多种植物，如拟南芥、水稻、玉米中已发现了各类的PEBP基因，植物PEBP基因的系统进化分析表明，该家族可分为FT-like､TFL1-like､MFT-like3个分支。

本研究中的Hd3a，是FT-like家族中成员之一，在水稻开花时间的调节中发挥着重要作用，近年来研究表明，Hd3a不仅参与了光信号和干旱信号诱导的水稻开花调控，而且在侧生分支形成，以及茉莉酸信号通路参与的抗病虫过程中都发挥着重要的作用。

这些研究表明，Hd3a在水稻生长发育和抗性响应上发挥着多效功能。

且我们在研究中首次发现，Hd3a参与ABA调控的种子萌发过程，这些研究结果不仅有助于探究Hd3a在种子萌发过程中的功能。

同时，Hd3a功能缺失，能够促进ABA信号通路相关基因表达的发现，也暗示了Hd3a在ABA信号通路调节中发挥作用，ABA途径与植物逆境响应密切相关，暗示Hd3a很可能在逆境响应中也发挥着重要作用。

我们在拟南芥和小麦中，也证实了PEBP基因家族成员，MFT-like和TaMFT与种子萌发过程有关，甚至拟南芥MFT-like，在ABA信号通路调控中的作用也被报道。

这说明，Hd3a参与ABA调控的种子萌发过程的生物学功能在进化上是保守的，但是由于PEBP基因家族成员功能的复杂性，水稻Hd3a如何作为一个基因表达调控的枢纽，介导多种信号通路相互作用，共同调控复杂的生长发育过程，值得深入研究。

高等植物的基因表达调控，通常发生在转录水平上，而启动子作为调控序列，决定着基因的转录方向，是研究基因表达和转录调控原理的关键。

我们通过对Hd3a的启动子序列进行分析，发现存在MYB、GARE、ABREs等顺式作用元件，暗示Hd3a可能作为一个非生物胁迫诱导型启动子，接受各通路的诱导信号，对植物的生长发育进行调控。

实验研究中发现当用ABA处理后，Hd3a的表达量随处理时间的延长不断降低，从转录水平上说明，Hd3a会受到ABA的诱导。

同时荧光素酶标记实验也证实了，ABA可通过抑制Hd3a的启动子对其进行调控。

在水稻中已报道多个bZIP转录因子，能够与顺式作用元件ABRE相结合，调控ABA信号转导和逆境胁迫响应，我们推测，这些与ABRE相结合的转录因子，很可能与Hd3a启动子相结合，来调控Hd3a的转录。

同时，已有研究表明，PEBP家族蛋白定位于细胞核，其家族成员不具有结合DNA的能力。

近年有研究表明，类FT蛋白和类TFL1蛋白与转录因子相互作用，并作为转录共同调控因子发挥作用。

在开花时间调节过程中，FT/TFL1与bZIP转录因子FD相互作用，形成具有或不具有14-3-3蛋白GF14c的花原激活复合物，进而对开花进行调控。

在水稻中，14-3-3蛋白家族成员广泛参与生物和非生物胁迫调控，更有研究表明，14-3-3蛋白家族成员之一GF14e，能够促进ABA和盐胁迫响应。

水稻GF14c和GF14e蛋白质序列高度同源，这使得Hd3a与GF14e一起调控ABA信号通路成为可能。

综上所述，在水稻中，多种生物和非生物因子能够调控Hd3a的表达，Hd3a的转录呈现时空特异表达的特点，进而调控多种生长发育和胁迫响应活动。