文|小张

编辑|小张

前言

传染性鲑鱼贫血病毒 (ISAV) ，是一种正粘病毒，是造成大西洋鲑 ( Salmo salar ) 水产养殖大量损失的重要原因。

目前可用的治疗方法和疫苗并不完全有效，因此选择性育种以生产抗 ISAV 的大西洋鲑鱼品系，是该行业的当务之急。

基因组选择和潜在的基因组编辑，可用于增强水产养殖种群的抗病性，这两种方法都可以受益于，对 ISAV 抗性基因组机制的更多了解。

为了提高我们对大西洋鲑鱼 ISAV 抗性潜在机制的理解，我们对感染 ISAV 的鲑鱼进行了一项转录组学研究，用来进行解决这一问题。

鲑鱼的ISAV病毒

大西洋鲑鱼是一种在全球多个国家养殖的珍贵鱼类，在支持许多农村社区的经济方面发挥着重要作用。

然而，该行业的可持续性目前受到传染病的威胁，这可能会造成重大的经济损失。对鲑鱼养殖最具威胁的疾病之一，是由传染性鲑鱼贫血病毒 (ISAV) 引起的传染性鲑鱼贫血。

ISAV 被 OIE列为法定传染病，并被欧盟参考实验室 (EURL) 归类为 C + D + E 类疾病。

这意味着对养鱼场中病毒的存在进行积极监测，并在发现后扑杀种群，以避免将病毒传播到其他养鱼场。

尽管如此，许多鲑鱼生产国都爆发了 ISAV，2009 年在智利爆发的疫情尤其具有破坏性，造成75 %的生产损失。

ISAV 属于正粘病毒科，因此与流感病毒有关。ISAV的入口好像有多个；鳃是进入的主要组织，但也可能通过皮肤和胸鳍感染。

在大西洋鲑鱼中，这种病毒会导致严重的贫血和出血，这是所有器官外周血管内皮细胞受损的结果，最终导致动物死亡 。

如今，对该疾病的控制主要依靠养殖场监测，和限制受感染/疑似养殖场的鱼类活动。

一些针对 ISAV 的疫苗已经开发出来，并在受影响的国家广泛使用，但它们不能提供针对该疾病的全面保护，因此受影响的农场仍然必须隔离和扑杀他们的鱼。

一种潜在的替代方法是通过，选择性育种或基因组工程生产对 ISAV 具有抗性的种群。

了解分子通路并发现参与 ISAV 抗性/易感性的功能基因，可以显著促进基因组选择，这是确定合适的基因组编辑靶点的必要步骤。

先前关于大西洋鲑鱼 ISAV 感染的体内研究已经确定了可能与耐药性相关的宿主基因，例如 hivep2 和 TRIM25 。

然而，对疾病的抵抗力在本质上往往是多因素的，涉及不同的生物途径和复杂的生物体水平反应，这些反应决定了宿主-病原体关系的平衡。

在之前的一项研究中，我们研究了大西洋鲑鱼对耐药和易感鱼类心脏中 ISAV 感染的反应。

结果显示，与未感染的鱼相比，受感染的鱼的补体和凝血途径下调，并强调 TRIM25 是抗 ISAV 的潜在良好候选者。

ISAV 抗性的基因组基础

为了更好地了解 ISAV 感染期间鱼类的全身反应，我们将 RNA 测序研究扩展到另外三个组织：鳃、头肾和脾脏。

选择这些组织是因为它们在 ISAV 感染中的作用；头肾和脾脏是鱼类主要的免疫器官，而鳃是重要的免疫屏障，也是ISAV的主要侵入点。

评估了这些大西洋鲑鱼组织对感染的转录组学反应，并比较了具有遗传抗性和易感性的动物，以更好地了解对 ISAV 抗性的基因组基础。

对总共 24 个头肾、24 个脾脏和 24 个鳃样本进行了 RNA 测序（3' mRNA 标签库），每个样本平均产生 13 M 读数。

主成分分析显示每个组织的样本明显聚类，但在每个组织内未观察到，对照样本和感染样本之间的分离。

对照和感染样本之间的差异表达分析显示，在 7 dpc 时，鳃、头肾和脾脏分别有 172、417 和 145 个基因差异表达。

在 14 dpc 时，鳃和头肾的差异表达基因数量相似，分别为 213 和 438 个基因，但在脾脏中只有 4 个基因差异表达。

通常，在每次比较中观察到，相似数量的上调和下调基因，除了攻击后 14 天的头肾，其中观察到更多数量的上调基因。

差异表达基因主要是器官特异性的，但三种组织中也有少量差异表达基因。在 7 dpc 时有 3 个常见基因（肽基-脯氨酰顺反异构酶 FKBP5、FKBP5）。

间脑/中脑同源框蛋白 1-B、DMBX1 和丝氨酸蛋白酶 23），在 14 dpc 时只有 1 个。

FKBP5（一种亲免素）和 DMBX1（一种转录抑制因子）均在 7 dpc 时上调，而丝氨酸蛋白酶 23 在 7 dpc 时下调。

最后，SOWAHC 是锚蛋白重复结构域 (ANKRD) 家族的一部分，该家族介导蛋白质相互作用并下调 14 dpc。

大西洋鲑鱼鳃对 ISAV 的反应

在鳃中，分别在 7 和 14 dpc 观察到 172 和 213 个差异表达基因，其中 46 个在两种条件下共享。基于基因本体论 (GO)，各种生物过程 (BP) 被鉴定为富集，攻击后 7 天显示更高的富集。

在 7 dpc 时，“应激反应”、“蛋白质折叠”、“代谢过程”、“免疫系统过程”、“细胞周期”或“自噬”等过程在下调基因中得到丰富。

而在 14 天后挑战类似的过程，如“对压力的反应”和“免疫系统过程”仍然在下调基因中得到丰富。

这表明对鳃感染缺乏反应，尽管与主要组织相容性复合体 II 相关的三个基因和两个 CC 基序趋化因子在攻击后 14 天上调。

大西洋鲑鱼头肾对 ISAV 的反应

在头肾中，与对照鱼相比，分别在 7 和 14 dpc 发现了 417 和 438 个差异表达基因，两个时间点之间共有 126 个。感染后第 7 天和 14 天，许多生物过程在头肾中富集。

在 7 dpc 时，上调基因最丰富的过程包括“翻译”、“核糖体生物发生”、“蛋白质靶向”和“分解代谢过程”。

而其他有趣的术语如“核糖核蛋白复合物组装”、“细胞死亡”和“细胞周期”表现出更适度的富集。

与鳃结果类似，下调基因最丰富的过程是“对压力的反应”、“细胞分裂”和“细胞周期”。

在攻击后 14 天，术语变得不那么丰富，但例如“核糖体生物发生”和“核糖核蛋白复合物组装”更加丰富。奇怪的是，在这两个时间点，细胞成分术语“核糖体”是最丰富的。

虽然我们没有观察到与免疫相关的生物学过程的丰富，但我们确实观察到多个干扰素。

相关基因在后第7天和第14天上调的GTP结合蛋白Mx，logFC=3-59;干扰素诱导的GTP结合蛋白44，logFC=2.01;

扰素调节因子7，logFC=1.63与NLR途径相关的基因，如蛋白质NLRC5(logFC=1.46)或蛋白质NLRC3(logFC=0.95)也在14日龄上调。

大西洋鲑鱼脾脏对ISAV的反应

脾脏中只有145个和5个基因在7日龄和14日龄时有差异表达，两者之间没有共同的基因。脾脏中丰富的生物过程与病毒感染没有明显的联系。

另一方面，7天后下调基因的富集术语包括“应激反应”、“蛋白质折叠”、“细胞死亡”和“细胞周期”。

鳃、头肾和脾脏抗 ISAV 的基因组特征

在每个时间点，根据它们各自的 EBV 和家庭死亡率，将 4 条鱼归类为抗性，4 条归类为易感。

耐药组和易感组对 ISAV 耐药的平均 GEBV 分别为 0.05和 0.41，每组的平均家庭存活率为 64% 和 17%。比较了每个组织和时间点的抗性，和易感鱼的转录组（4 条抗性鱼和 4 条易感鱼）。

在鳃中发现了少量抗性和易感样本之间的差异表达基因，其中一些基因与免疫反应有关。例如，含有 NACHT、LRR 和 PYD 结构域的蛋白 1 样 (NLRP1)，是炎症小体的关键成分，在 7 dpc (logFC = − 2.8) 时在易感样本中表达更多。

同样在 7 dpc，磷脂酶 A1 成员 A 样异构体 X3 (PLA1A)，参与 I 型 IFN 生产，在抗性样品中表达更多（logFC = 5.7）。

在14 dpc时，一些差异表达基因参与反应性感染，如ATRX样转录调节因子（ATRX，logFC = 6.4），其在单纯疱疹病毒异染色质的维持中发挥作用。

病毒异染色质是在裂解感染期间形成的，其中核小体组装在病毒 DNA 上，并作为病毒基因表达的表观遗传屏障。

聚腺苷酸结合蛋白 1 样 (PABC1) 在 14 dpc时在抗性鱼中表达较少，该基因的细胞分布在各种病毒感染中发生改变。一种参与泛素化的基因，泛素结合酶 E2 D2 (UBE2D2)，在抗性鱼中也较少表达 (logFC = − 0.95)。

我们进行了一项多组织 RNA 测序实验，以补充我们之前关于心脏对 ISAV 反应的工作，并获得大西洋鲑鱼对这种病毒感染反应的系统观点。

ISAV是一种影响整个生物体的疾病，其中病毒使用血管在鱼体内循环，在多个组织的表皮中繁殖。

除了全身免疫反应外，每个组织对病毒的反应也不同，因此多组织方法对于理解这种宿主-病原体相互作用很重要。

本实验研究的三种组织是鳃、头肾和脾脏，之所以选择它们是因为它们参与了免疫反应和/或病毒进入鱼体内。

在这三种组织中观察到的转录组学变化比我们之前研究中在心脏中观察到的变化要温和 。这与病毒的发病机制一致，潜伏期为 10-20 天 。

我们的结果表明，到第 15 天时，ISAV 尚未在整条鱼中传播，并且它已设法限制系统免疫反应。事实上，在 14dpi 时，仅在 2 条鱼的鳃和脾脏以及 1 条鱼的头肾中检测到病毒。

尽管如此，观察到的对 ISAV 的反应在三个选定的组织中明显不同，具有少量常见的差异表达基因。

其中两个基因可能在对 ISAV 的反应中发挥重要作用：FKBP5 和丝氨酸蛋白酶 23。之前曾报道 FKBP5 等亲免疫素在某些感染（如 HIV-1）期间参与病毒复制。

关于丝氨酸蛋白酶 23，ISAV 具有融合糖蛋白 (F) 和血凝素酯酶 (HE)，两者都是病毒附着和内化进入鲑鱼细胞所必需的。必须切割甲型流感病毒才能进入细胞，这是由宿主细胞分泌的丝氨酸蛋白酶完成的。

基因组的实验结果

在三个时间点（攻击前、攻击后 7 天和 14 天）从 12 条抗性和 12 条易感鱼身上收集三种不同的组织（鳃、头肾和脾脏），并对 RNA 进行测序。

在每个时间点比较感染和未感染鱼以及抗性和易感鱼的转录组。结果表明，对 ISAV 的反应是器官特异性的。

在头肾中观察到对感染的重要反应，免疫过程如干扰素和 NLR 途径上调，而在鳃和脾脏中反应更为温和。

除了免疫相关基因外，我们的结果表明其他过程，如泛素化和核糖体加工在 ISAV 的早期感染过程中也很重要。

而且ISAV 对大西洋鲑鱼的感染，揭示了一种器官特异性反应，这意味着感染期间的不同功能。

在这些早期时间点，在头肾中观察到免疫反应，而相比之下，鳃和脾脏表现出适度的反应。抗性和易感样本之间的比较突出了，对进一步研究感兴趣的基因，例如与泛素化或炎性体相关的基因。

笔者观点

ISAV 感染的大西洋鲑鱼的转录组学分析揭示了复杂的组织特异性反应。与鳃和脾脏相比，每个组织对感染的反应不同，头肾呈现出大量免疫反应相关基因。

遗传抗性和易感动物的比较表明没有单一的明确抗性机制，这与大西洋鲑鱼 ISAV 抗性的多基因性质一致。

我们的结果还表明，对 ISAV 的抗性可能不仅纯粹依赖于免疫途径和细胞机制，因为翻译后修饰或各种细胞内，转运途径也可能有助于 ISAV 抗性。

参考文献