基于CCD图像原理设计DNA芯片扫描仪，用自动对焦校准技术突破难关

文 | 爱嘤斯坦丁

编辑 | 爱嘤斯坦丁

«——【·前言·】——»

DNA芯片（DNA microarray）是一项重要的高通量生物技术，它能够同时检测上千个DNA序列，并用于研究基因表达、SNP分析、DNA体系结构变化等生物学问题。

在DNA芯片技术应用中，DNA探针的强度和位置信息是非常重要的，而DNA芯片扫描仪，则是收集这些信息的主要设备之一。

芯片扫描仪的设计和实现是一项技术复杂、综合性强的任务，其中最重要的是扫描仪的像质量量和自动对焦校准功能。

基于CCD图像的DNA芯片扫描仪，通过使用数字图像处理技术来提高样本图像的分辨率和信噪比，并且能够自动对焦和校准，具有良好的应用前景。

«——【·DNA芯片扫描仪研发的意义·】——»

DNA芯片技术在生命科学领域迅速发展，它是利用核酸分子碱基互补配对原理，通过各种技术将核苷酸固定在载体上，然后与经过处理的样品杂交，完成对样品基因的大规模检测。

DNA芯片可广泛应用于药物研究、疾病诊断、基因结构和功能研究等领域。为了将其生化反应转化为有意义的信息，需要使用DNA芯片扫描仪。

DNA芯片技术伴随着基因研究的发展，满足了人类对基因探索的需求，以基因芯片为代表的生物芯片技术，深入研究和广泛应用将对人类生活和健康产生深远影响。

Affymetrix公司是最早进行DNA芯片技术研究的公司之一，该公司开发的GeneChip Scanner 3000 7G具有最大探测灵敏度为每平方微米0.5个荧光单位，并且检测时间为5-10.5分钟。

微阵列扫描仪具有最大分辨率2µm，以这种精度扫描芯片需要24分钟。GenePix系列扫描仪在可调范围为5到100 µm，以10 µm分辨率拍摄双通道扫描速度为6.5分钟。

北京博奥在数组芯片扫描仪的开发和商业化方面取得了重大进展，该公司的晶心LuxScan系列芯片扫描仪具有高达5µm的检测分辨率和30s/cm2的检测速度。

基因芯片检测的两种主要方法，一种是基于光电倍增管的激光共聚焦方法，另一种是基于带有高压氙或汞灯的CCD的成像方法。

激光共聚焦方法将激光聚焦到几微米的区域，并在芯片上来回扫描以激发单个像素，然后由光电倍增管将结果转换为数字信号。

CCD成像方法将光源过滤成窄带波长范围，照射芯片的大面积，激发荧光标记产生荧光，然后使用CCD相机捕获图像。

激光共聚焦方法具有较高的灵敏度优势。但是，探针必须逐点扫描，检测持续时间长，硬件结构复杂，增加了制造、维护和推广的难度。

CCD方法可以一次成像，缩短检测时间，但光源设计和光路中残余光的消除要求严格。

随着半导体技术的快速发展，高功率LED和高灵敏CCD的开发取得了显著进展。

在研究中，应放弃传统的高压氙或汞灯方法，以避免高热量发生、工作寿命短和价格高的缺点。

可以通过采用高功率LED光源并设计紧密匹配的光路，我们建立了所提出的DNA芯片扫描仪。

在基于CCD的扫描仪中，由于成像镜头的焦点非常敏感，仪器移动或玻璃装载平台的加载或卸载时，镜头很容易失焦，并且模糊了捕获的图像。

手动对焦校准操作难以进行、耗时费力，而且不便使用。对此提出了一个简单易用的对焦硬件结构，只对扫描仪的原始结构做了轻微的改变。

此外应研究图像清晰度评估函数、校准窗口选择和焦点搜索策略，以满足自动对焦校准的要求。

«——【·扫描仪结构·】——»

所提出的扫描仪由光源、匹配光路和控制模块组成。高功率LED被用作光源，红色和绿色双通道高功率LED位于芯片的左右两侧和上方。

LED光通过曲面透镜和滤光片照射到DNA芯片上。通过光路的吸收、带走或阻挡，将芯片发出的荧光捕捉到CCD相机中，避免了杂散光的干扰。

控制模块使用STM32单片机执行玻璃装载平台的进出、滤光片的切换以及对焦校准和按钮的控制等功能。

«——【·光源选择·】——»

单个LED很难满足基因扫描仪对高强度的需求，不过具有多个灯珠的LED阵列会导致光利用率低和光学透镜设计复杂。

经过测试不同的光源后，最采用了高功率LED光源PT54，该光源具有稳定的性能、高亮度和小的发光面积，可以在5 mm2内达到30 W以上。

由于PT54近似于Lambertian光源的扩散，光的散角很大，聚光性差，根据PT54光源的照度分布特性，使用曲面透镜，这些透镜减小了光源的散角，提高了光的利用和聚光性能。

«——【·光路设计·】——»

由于与杂散光相比，基因芯片发出的荧光强度非常微弱，即使使用高性能的窄带滤光片，也很难去除杂光，光路设计的关键是消除杂散光。

通过广泛的实验和模拟，我们发现光路中的杂散光来源是生物芯片外部区域、生物芯片玻璃和仪器底部的多次反射。

考虑到这一点，特别采用了下图所示的方案来消除杂散光。该方案由一个光入口、一个灭光暗室、一个光圈和一个灭光器组成。

为了模拟设计的光路，可以使用OptisWorks软件追踪了1×104条光线。光线分布如下图所示，光照射到生物芯片后，大部分光线被传输到灭光暗室，并反射到左边区域。

少量的杂散光被反射并被光圈挡住。只有少量的杂散光能够进入摄像机，最后被发射滤光片过滤掉。

模拟结果显示，光路的杂散光消除效率为99.95%。基因芯片中心区域的30mm x 30mm内照明均匀性大于92%。通过这些特别设计的光路和滤光片，杂散光被有效消除。

«——【·自动对焦校准的设计·】——»

对焦可以通过调整图像距离、物距或成像透镜的焦点来进行校准。调整图像距离会改变成像系统的后拦截器，破坏CCD和成像透镜的完整性。

之后应调整物距，通常是通过上下移动生物芯片的玻璃负载台来实现，有两个缺点：一个是实现平台上下移动的控制需要更加复杂的硬件。另一个是调整物距会改变成像比例，降低荧光收集效率。

调整成像透镜的焦点只需要额外的对焦电机和连接电机和透镜的连接器，但它具有低成本和对扫描仪影响小的优点，因此选择它作为对焦校准方案。

«——【·扫描仪原型·】——»

仪器检测和焦距自动校准过程均需要相机采集荧光图像，为此实验人员专门设计并制造了一台扫描仪原型，以适应捕捉弱荧光、相机价格有限以及减少热噪声的影响。

原型包括一个CCD相机，一个宏观镜头，一个STM32控制板和一个对焦电机。黑色铝制框架是扫描仪的光路结构。LED的背面有水冷散热器，光路的上部是CCD相机。

镜头和对焦结构位于光路结构的后侧。经过多次测试和分析，将对焦电机的驱动电流设置为0.5 A，驱动器的细分精度设置为每圈400个脉冲。

«——【·评估函数的比较·】——»

在焦距校准过程中，需要确定图像的清晰度以确定焦点状态，同时需要考虑空间域函数，包括平方梯度、Brenner、TenenGrad和方差、频域、图像熵，以及统计函数。

与模糊图像相比，清晰图像具有更锐利的边缘，像素值在空间分布上更为集中，像素值大小的差异相对较大，因此可以根据空间特征进行清晰度评估。

成像系统等效于与截止频率和焦外表现相关的低通滤波器，因此可以先将图像从空间域转换为频率域，然后可以根据频率域中的高频分量进行清晰度评估。

与模糊图像相比，清晰图像的灰度图像分布更加多样化和离散化，图像的熵更小。可以根据图像熵进行清晰度评估，统计评估函数主要通过图像像素值的统计特征来确定图像的清晰度。

系统中成像镜头的可调焦距范围为60mm，通过每隔2.5mm一次在透镜的两端拍摄25张图像，从模糊到清晰再到模糊的全过程中获得了这些图像。

从中可以看出，图像熵违反了单峰性原则。平方梯度、Brenner和TenenGrad函数在整个焦距范围内只有一个最大值，但它们并不是严格单调的，仍然违反了单峰性。

使用实时性能来衡量图像清晰度，评估的复杂性和处理效率，自动对焦校准过程中需要评估数十张图像。

在初步流程中，对于方差、Vollath's和傅里叶变换函数，25张图片的平均处理时间分别为0.92、0.71和1.65秒/张。

计算机采用了Intel Core i5处理器，频率为2.20 GHz，内存为4GB。因为傅里叶变换函数必须将图像从空间域转换为频域，然后进行分析，所以它花费的时间最长。

加入高斯噪声后，三个清晰度评估函数的峰值变小，两端的评估值从原来的10-13-14-17上升。

峰值下降是因为锐利图像的评估受到高斯噪声的某些干扰。在远离准确对焦位置的两端，成像系统接收到的有用信号过少。

锐度评估函数将一部分高斯噪声计算为有用信号，导致两端增加，添加噪声后，三个函数仍满足单调性。

经过对单峰性、灵敏度、抗噪声和实时性能的比较，明确选择了方差函数进行对焦校准。

在焦距校准过程中，校准窗口的选择涉及到清晰度的评估；可以是自适应选择或固定区域选择。

自适应选择适用于对焦图像不固定的应用，该过程复杂，需要进行大量计算。固定区域选择选择图像上固定的一个或多个区域作为评估区域，通常用于对焦图像的固定前景目标，它具有计算简单且小的优点。

确定了固定区域选择后，需要考虑是选择三重荧光点阵窗口，还是选择单一荧光点阵窗口作为清晰度评价区域。为了比较以上两种方法，应计粗略对焦的方差函数。

无论选择单一荧光点阵还是三重荧光点阵作为图像对焦校准窗口，评价曲线都满足单峰性。当对焦位置偏离精确对焦位置较远时，三重荧光点阵的评价曲线会上升。

这是因为两端的图像包含的有用信息较少，而三重荧光点阵区域更大，包含更多的信息，导致评价值较高。

计算三重荧光点阵所需的计算量是单一荧光点阵的三倍以上。在对焦过程中需要评估数十个图像，因此系统中当然要选择单一荧光点阵区域作为对焦校准窗口。

«——【·基于爬山法的对焦步进搜索策略·】——»

为了完成自动对焦校准过程，除了改善硬件和选择合适的图像清晰度评价函数和校准窗口外，我们还需要决定如何控制步进电机。

如何确定正确的步长仍然是一个开放性问题，为了提高实时性能，可以采用了粗略和精细过程相结合的校准方法。

即先使用大步长，直到接近精确对焦位置，然后选择小步长。由于对焦步进电机的驱动轮模数为0.5 mm，因此精细校准的步长大小固定为0.5 mm。经过试错，选择了5 mm的步长作为粗略校准的步长。

确定步长后，设计了一个包括四个步骤的“爬山”搜索：初始图像采集、对焦状态判断、粗略校准和精细校准。

首先以粗略步长为中心对称地采集五幅图像帧，包括位于初始位置两侧的图像，然后评价它们的清晰度分别为F（-2）、F（-1）、F（0）、F（1）和F（2）。

对焦状态判断：如果F（0）是五个清晰度值中的最大值，则在粗略校准条件下，最清晰的对焦位置就在初始位置处。

在实验中可以跳过粗略校准，直接进行精细校准。否则，需要进行粗略校准，并决定方向。

如果从F（-2）到F（2）的数值单调递增或递减，则粗略校准的方向是朝着较大的清晰度；否则，粗略校准的方向是朝着F（-2）到F（2）之间的最大值。

沿着校准方向采集两幅图像，如果第k帧图像的清晰度评价值大于后两幅图像的评价值，则第k帧图像的对焦位置就是粗略校准下的精确对焦位置。否则，需要重复此过程，直到满足条件为止，完成粗略校准。

精细校准：精细校准过程类似于前三个步骤，不同之处在于校准步长为0.5 mm。

由于对焦电机是步进电机，其驱动轮模数为0.5 mm，因此精细校准的步长大小固定为0.5 mm。

«——【·使用自动对焦校准的扫描仪的性能评估·】——»

使用精度、重复误差和实时性这三个指标来衡量自动对焦校准的质量。需要通过四个指标来评估整个仪器的检测性能：荧光通道数、效率、灵敏度和分辨率。

设计基于图像的DNA芯片扫描仪，具有红色和绿色的双通道，与主流仪器相符，扫描30 mm x 30 mm探针区域的单通道检测时间只需要55秒，比激光共聚焦模式少。

将对焦自动校准到准确位置后，通过将其结果与同一DNA芯片上其他商业仪器的结果进行比较来评估扫描仪的检测性能。

通过方差函数将荧光图像的清晰度，与手动对焦校准的清晰度进行比较，以评估自动对焦校准的准确性。

可以通过收集两种对焦模式下的荧光图像，并比较图像的清晰度来获得结果。具体步骤如下：

手动将对焦调整到最清晰的位置，采集荧光校准芯片的图像，随机旋转对焦轮，自动将对焦校准到准确位置。

再次采集校准芯片图像，需重复上述步骤10次，然后计算表中显示的清晰度。

«——【·总结·】——»

经过反复试验，成功地设计和实现了一种基于CCD图像的DNA芯片扫描仪，该扫描仪具有自动对焦和校准功能，并且能够通过数字图像处理技术高效地处理样本图像。

实验结果表明，该扫描仪能够准确地检测出DNA探针的位置和强度信息，具有广泛的应用前景，可用于基因组学研究、药物研发等领域。

参考文献：

1."Design and Implementation of a High-Speed DNA Chip Scanner with Automatic Focusing Calibration," by Y. Zhang, H. Wang, Q. Liu and J. Li, IEEE Transactions on Instrumentation and Measurement, vol. 68, no. 11, pp. 4126-4133, Nov. 2019.

2."Development of a Fluorescence-based DNA Microarray Scanner with Automated Focusing," by K. Miyoshi, H. Kojima, Y. Nakabayashi and T. Sasaki, Analytical Sciences, vol. 35, no. 8, pp. 965-970, Aug. 2019.

3."A High-Throughput CCD-Based DNA Array Scanner with Automated Focusing," by C. Chiu, C. Wu and H. Chang, Journal of Biomedical Science and Engineering, vol. 9, no. 10, pp. 585-594, Oct. 2016.

4."A High-Speed DNA Microarray Scanner with Auto-Focusing and Image Enhancement Techniques," by T. Chua, H. Li, X. Chen, G. Li and K. Soh, Sensors, vol. 14, no. 6, pp. 10334-10354, Jun. 2014.

5."Development of a High-Resolution CCD-Based DNA Microarray Scanner with Auto-Focusing Function," by Y. Chen, G. Liu and Y. Zheng, IEEE Transactions on Biomedical Engineering, vol. 60, no. 10, pp. 2762-2770, Oct.